PCR反应的五要素指的是什么

①PCR反应的五要素指的是什么

1、引物，引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。

2、酶，目前有两种聚合酶供应。

3、dNTP，dNTP的质量与浓度与PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状。

4、模板，模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。

5、镁离子浓度，镁离子对PCR扩增的特异性和产量有显著影响。

②PCR纯化的方法

1、先用溶液溶解掉含有DNA的琼脂糖凝胶，然后将其加入到含有吸附柱的离心管中，使得吸附柱能够吸附住DNA。然后再通过离心，将含有琼脂糖的溶液去除掉；

2、接下来加入去盐的漂洗液进一步去除杂质。由于PH值的原因，DNA还是会被吸附在吸附柱上的膜上；

3、最后加入纯水或者TE溶解液，在这个条件下DNA会溶解在其中。可以通过离心将液体分离下来，这样得到的液体就是纯化好的PCR产物。

③请教梯度PCR设置梯度问题

梯度PCR是为第一次使用某条引物，为了摸索最佳退火条件设定，拿到引物时，会得到建议的Tm值，由于两条引物不同，可算出一个退火温度，但这个退火温度不一定是最佳反应条件，因此可以设定退火的梯度，最常用的为10℃，这样每一个反应都有一个退火温度，最后电泳时，可以观察到在哪一个退火温度下，PCR产物产量和特异性都有保证，这样后面就可以选这个温度进行试验，但是对于已经有最佳条件的引物，或反应体系，不需要做梯度PCR。

④PCR基因扩增原理

将待扩增的模板DNA变性使之成为单链，DNA样品中，特异性的引物能够与其互补的序列杂交，在脱氧核苷三磷酸和Taq酶存在时，就可以合成模板 DNA的互补链，反应完成后，将反应混合物加热使DNA双链变性，温度下降后，过量的引物又可以开始第二轮的合成反应。这种延伸，变性，退火，延伸的循环可以重复多次，使所需要的DNA片段得到特异性的扩增。